室外培养料第二次发酵是在第一次发酵结束后，趁着料温未降时重新建堆。建堆前在堆底开－条通气沟。堆好后用草帘盖好。夜间及雨天用塑料膜覆盖，其内用竹枝撑起约２０公分距离。建堆后第二天料温应升至摄氏６０度，保持４－６小时，然后掀起覆盖物降温至摄氏５０－５２度，这时候要用插棒插一些５公分深的小孔，加强透气。如此保持４－５天，趁着料温未降时及时进房。
不过，对蘑菇培养料进行二次发酵时要注意几个问题：
１、进行二次发酵的培养料无论是室内或室外进行，都要趁第一次发酵的料温未降时赶快进行。２、第二次发酵后经过升温，水分有蒸发散失。发酵后要适当补充水分，补充的水温要与料温－致为好。３、第二次发酵时间一般４－５天，时间不宜过长。及时进房。４、室内进行第二次发酵的，播种前一定要做好室内的换气工作。５、室外进行第二次发酵的，要保证堆温按时提升或降低，加强透气，培养料质量才有保证。
经过第二次发酵的培养料进一步熟化，促使大量有益微生物生长发育，促进养分分解和有效养分的积累，并杀灭培养料中的害虫及有害微生物，使蘑菇菌种的菌丝体在最短时间内适应营养环境，顺利生长发育。
优质的培养料应该是质地松软亮泽，粪料松散软绵，变成灰褐色，但不是黑色，无结块，无氨味，无粪臭味，无酸腐味，无霉味。草料柔润有韧性，成条状，用力可拉断。用指甲刮草条，表皮易脱离但不断，无臭味而有草香味，不霉烂、黄褐色。用手捏培养料指间有水渗出，成团，不粘糊，松手可散开。酸碱度６．８－７．２。最后一次翻堆后的第五天仍有摄氏５０度以上，但不超过摄氏６０度。堆的体积缩小了４０％左右，料的重量减少了３０％左右，含水量大约６５％为宜。
